Иммобилизация углеводородокисляющей культуры candida lipolytica на поверхность твердых сорбентов

Насибуллина Диана Динаровна *
Якшидавлетова Лилия Ильясовна **

В процессах добычи, транспортировки, хранения и переработки нефти и нефтепродуктов происходит их попадание в окружающую среду, вследствие технологических потерь и аварийных ситуаций, что приводит к загрязнению природных экосистем, прежде всего, почвенных. Для очистки нефтезагрязненных почв применяются различные технологии, отличающиеся по способу деструкции нефтепродуктов (механические, физико-химические, биологические), аппаратному оформлению, длительности процесса, достигаемой эффективности, экономическим затратам [1-4]. Распространенной технологией очистки нефтезагрязненных почв является технология биоремедиации. Перспективным направлением по интенсификации очистки объектов окружающей среды от нефтепродуктов с помощью микроорганизмов является использование биосорбентов, получаемых путем иммобилизации микроорганизмов на поверхность сорбента. В качестве носителя для получения биосорбента обычно используют различные материалы.

Целью данной работы являлся поиск условий иммобилизации клеток углеводородокисляющей культуры Candida lipolytica [5,с.1229]на поверхность твердых сорбентов вермикулита, керамзита, древесных опилок и выявление оптимальных условий биодеградации дизельного топлива полученными биосорбентами.

Вермикулит - минерал серебристо-золотистого цвета, образовавшийся в результате природных процессов гидратации и других процессов изменения ферромагнезиальных слюд. Вермикулит инертен к органическим растворителям, нерастворим в воде, не имеет запаха, не поглощает влагу, не имеет раздражающих свойств. Вермикулит обладает хорошими сорбционными свойствами для газовых и жидкостных сред. Размеры частиц 1х2 мм. Применяется для утепления и огнезащиты зданий.

Керамзит - глинистый материал, который получают искусственно из вспученной глины среднего обжига. Представляет собой зерна размером 5-40 мм. К отличительным его свойствам можно отнести особую стойкость к морозу, огнестойкость, отсутствие примесей.

Древесные опилки - это вторичный продукт, получаемый в результате обработки древесины. В данной работе использовали хвойные опилки, являющиеся отходом лесотехнической промышленности республики Башкортостан. Этот материал имеет очень малый вес. Размер частиц 10х3 мм. Использовали воздушно-сухое сырье.

Для изучения влияния перемешивания на степень и время иммобилизации клеток Candida lipolytica сорбенты и все компоненты питательной среды предварительно подвергали стерилизации путем автоклавирования в течение 1,5 часов. Дизельное топливо в среду вносилось однократно в начале эксперимента. Совместную инкубацию культуры и сорбента осуществляли в течение 10 суток при температуре 24°С.

Для выявления присутствия жизнеспособных клеток микроорганизмов через равные промежутки времени осуществляли посев из культуральной жидкости на агаризованную питательную среду. Количество колоний микроорганизмов определяли методом прямого подсчета. Параллельно осуществляли посев частичек сорбентов на поверхность агара для обнаружения присутствия связанных с сорбентами клеток микроорганизмов.

На 2-е сутки после начала эксперимента на поверхности твердых сорбентов при посеве на агаризованные среды выявлены многочисленные колонии Candidalipolytica. На 8-е сутки культивирования количество клеток составило (на 1 мл суспензии) 135000 кл/мл колоний в опыте с вермикулитом, в опыте с керамзитом 114000 кл/мл колоний и в опыте с древесными опилками 123300 кл/мл. Как видно, наибольший прирост биомассы выявлен на поверхности вермикулита в условиях перемешивания с помощью микробиологической качалки.

С целью выявления влияния перемешивания на микробиологической качалке оно была заменено на аэрацию при помощи OXYBOST-300 c мощностью 2,5 л/мин. Аналогично вышеописанному испытанию осуществлялись посевы на агаризованные среды через равные промежутки времени. На 2-е сутки после начала эксперимента на поверхности сорбентов при посеве на агаризованные среды выявлены многочисленные колонии Candidalipolytica. В посевах из культуральной жидкости на 3-6-е сутки зафиксировано сплошное зарастание. Подсчитать количество клеток стало возможным на 8-е сутки. Оно составило 144000 кл/мл в опыте с вермикулитом, 293000кл/мл - с керамзитом и в опыте с древесными опилками 182600 кл/мл. При интенсивной аэрации происходит повышение роста биомассы на всех испытанных сорбентах, а наибольший прирост биомассы выявлен в опыте с керамзитом.

На следующем этапе исследования выясняли влияние предварительной стерилизации сорбентов перед проведением иммобилизации на их поверхность культуры Candidalipolytica, поэтому в этих опытах применяли предварительно не стерилизованные сорбенты. В посевах на агаре частиц сорбентов и культуральной жидкости через 10 суток после начала эксперимента, обнаружены бактериальные колонии. Было выяснено, что без внесения Candida lipolytica на нестерилизованных сорбентах прорастают многочисленные бактериальные колонии. По морфологическим и культуральным признакам выделенные бактериальные колонии были отнесены к родам:Sarcina, Bacillus (на вермикулите); Pseudomonas, Mycobacterium, Sarcina, Bacillus (на керамзите);Pseudomonas, Mycobacterium, Bacillus (на древесных опилках).

Таким образом, был осуществлен поиск условий иммобилизации клеток углеводородокисляющей культуры Candida lipolytica на поверхность твердых сорбентов - вермикулита, керамзита, древесных опилок. Показано, что интенсивное зарастание культурой поверхности сорбентов происходит в случае стерилизации всех исходных компонентов при активной аэрации в течение 24 час микробиологической суспензии с концентрацией 23*10⁶ кл/мл, при соотношении 20мл суспензии на 1г сорбента и наибольший прирост биомассы выявлен в опыте с керамзитом.

Установлено, что при отсутствии стерилизации компонентов системы на поверхности сорбентов прорастают дополнительные бактериальные колонии предположительно рода: на вермикулите (Sarcina, Bacillus); на керамзите (Pseudomonas, Mycobacterium, Sarcina, Bacillus); на древесных опилках (Pseudomonas, Mycobacterium, Bacillus).

Список литературы:

1. Астахов В.А, Дубинин М.М, Изучение свойств адсорбентов. 2003г.

2. Безбородое А.М. Биосинтез биологически активных веществ микроорганизмами. Л., «Медицина», 1969

3. Биотехнология. [Электронный ресурс]: URL: www.biotecnolog.ru

4. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. – М.: Колос, 2004. – 269 с.: ил. – (Учебники и учебные пособия для студентов высш. учеб. заведений).

5. Рябцева Н. Д., Никитина В. С., Кадиров А. А., Абдуллин М. И. // Вестник Башкирского государственного университета. Способность культуры Candidasp. к биодеградации нефтепродуктов. – 2015. - №4. – С. 1227-1229.